Lê Khôi sinh ra ở vùng đất Lam Sơn, Thanh Hóa (hiện chưa rõ năm sinh), trong một gia đình dòng dõi có truyền thống yêu nước, cha là Lam quốc công Lê Trừ, anh thứ hai của Bình Định vương Lê Lợi. Bởi vậy, ngay từ khi còn nhỏ, Lê Khôi đã được nuôi dạy, trui rèn để tiếp bước tông tổ. Lớn lên trong cảnh đất nước dưới ách đô hộ của giặc Minh, với lòng căm thù uất hận chất chứa trong lòng, Lê Khôi ấp ủ chí lớn và chờ đợi cơ hội. Tháng Giêng năm Mậu Tuất 1418, khi Lê Lợi dựng cờ khởi nghĩa ở đất Lam Sơn, Lê Khôi là một trong những hạt nhân tích cực tham gia hưởng ứng ngay từ đầu cuộc khởi nghĩa.
Trong suốt những năm chinh chiến, “nếm mật nằm gai” cùng nghĩa quân Lam Sơn, Lê Khôi luôn tỏ rõ là một con người can trường, chí lớn, sát cánh cùng Lê Lợi một lòng một dạ chiến đấu. Lê Khôi không chỉ là một chiến tướng tham gia chỉ huy quân sĩ lập công lớn trong nhiều trận đánh mà còn là một vị chỉ huy mưu lược. Ông chính là “kiến trúc sư’” của trận Bồ Ải nổi tiếng. Trong trận này, Lê Khôi đã tổ chức trận địa mai phục, dụ quân Minh vào rồi tiêu diệt. Trong trận đánh ở ải Khả Lưu, Lê Khôi chỉ huy quân sĩ cùng tướng quân Lê Sát tiêu diệt đạo quân Minh, bắt sống Đô đốc Chu Kiệt, chém chết Đô ty Hoàng Thành, bắt sống cả ngàn tù binh giặc Minh. Mùa xuân Đinh Mùi 1427, Lê Khôi chỉ huy mấy ngàn quân cùng đạo quân của Lê Sát, Phạm Vấn “tả xung hữu đột” trong trận Xương Giang, bắt sống các tướng Thôi Tụ, Hoàng Phúc cùng mấy vạn quân Minh, giải phóng Đông Đô. Trong chiến công oanh liệt kết thúc cuộc kháng chiến chống giặc Minh của quân, dân Đại Việt có vai trò và đóng góp to lớn của tướng quân Lê Khôi.
Năm 1428, Lê Lợi lên ngôi Hoàng đế, Lê Khôi được phong Kỳ lân hộ vệ Thượng tướng quân, Tổng quản hành quân, Nhập nội thiếu úy. Năm 1429, triều đình nhà Lê khắc ban biểu ngạch công thần khai quốc. Ông được phong Đình Thượng hầu (xếp thứ tư trong 9 bậc).
Đại Việt vừa trải qua chiến tranh, tình hình còn khá phức tạp, đặc biệt là ở vùng đất Thuận Hóa, địa bàn trọng yếu nằm tiếp giáp với Chiêm Thành. Vua Lê Thái Tổ nhận thấy cần phải tìm được một người có đủ đức, tài và đáng tin cậy để ổn định tình hình ở vùng đất này. Người đó không ai khác chính là Thượng tướng quân Lê Khôi. Năm Canh Tuất 1430, ông được nhà vua cho vào trấn trị vùng Thuận Hóa. Với kế sách “dùng đức để thu phục nhân tâm”, Lê Khôi đã lệnh cho bãi bỏ quy định “cấm chợ, ngăn sông”. Những cư dân lưu tán được chiêu mộ và tạo điều kiện thuận lợi, khuyến khích họ chăm lo sản xuất, khai hoang, trồng dâu, nuôi tằm. Một mặt chăm lo ổn định cuộc sống cho dân, mặt khác, ông chú trọng duy trì tổ chức luyện tập cho quân sĩ một cách thường xuyên... Bằng cách này, ông đã chiếm được lòng tin yêu của dân chúng trong vùng. Nhờ vậy mà tình hình ở Thuận Hóa nhanh chóng ổn định, bờ cõi được giữ vững, cuộc sống yên bình của người dân được bảo đảm. Về quan hệ bang giao, trong thời gian trị nhậm ở Thuận Hóa, Lê Khôi biết cách để giữ hòa khí với láng giềng. Sử cũ chép rằng, lúc bấy giờ, nhiều người dân Chiêm Thành ở khu vực biên giới xâm phạm bờ cõi Đại Việt bị bắt, được Lê Khôi cho quân sĩ đối đãi tử tế rồi tha cho về. Tiếng tăm, đức vọng của Thượng tướng quân Lê Khôi vì thế mà vang xa sang tận Chiêm Thành.
Đang gắn bó với vùng đất và con người Thuận Hóa thì Lê Khôi lại được nhà vua điều ra dẹp loạn ở vùng núi phía Bắc. Tại đây, ông đã chỉ huy đánh dẹp, phá tan lực lượng gây loạn, chống đối, bắt sống các thủ lĩnh Bế Khắc Thiệu, Nùng Đắc Thái, nhanh chóng trả lại sự yên bình cho vùng đất biên viễn ở phía Bắc.
Là một vị tướng dũng cảm và mưu lược, có công lớn trong việc ổn định tình hình, an dân bên trong, hòa nghị bên ngoài, Lê Khôi vừa được lòng dân vừa được Vua Lê Thái Tổ đặc biệt tin cậy. Năm Quý Sửu 1433, ông được nhà vua cho vời vào điện để bàn việc chính sự trước khi quyết định lập thái tử. Sau khi Lê Thái Tông lên nối ngôi, Lê Khôi tiếp tục được trọng dụng. Trên cương vị của mình, ông đã đóng góp cho nhà vua nhiều kế sách hay trong phép trị nước, dụng binh. Năm Đinh Tỵ 1437, Lê Khôi được thăng Nhập nội tư mã, Tham tri chính sự, coi việc quân.
Năm Kỷ Mùi 1439, bọn phản loạn ở vùng biên ải lại nổi lên quấy phá, cấu kết với quân Ai Lao cướp bóc châu Phục Lễ, Nhập nội tư mã Lê Khôi phò vua đem quân đi trừng trị. Dẹp yên được cuộc nổi loạn ở Phục Lễ chưa lâu thì ông lại tiếp tục theo vua kéo quân ra đánh dẹp bọn thổ quan nổi loạn ở vùng châu Thuận (Tây Bắc). Do lập được công lớn, Lê Khôi được tiến phong Nhập nội đô đốc, được tham dự triều chính. Mọi việc to nhỏ trong triều, ông đều được nhà vua hỏi ý kiến rồi mới quyết định. Một con người trung thành hết mực và được nhà vua rất tin cậy, song không rõ vì lý do nào mà sau đó, Lê Khôi đã rời chốn quan trường lui về an nhàn tại gia một thời gian. Khi Lê Nhân Tông lên ngôi (1442), nhớ đến một công thần tài đức vẹn toàn, nhà vua cho mời Lê Khôi về triều và ban chức Nhập nội thiếu úy, giao trông coi việc trong phủ Nghệ An (Đốc trấn Nghệ An).
Tháng Năm năm Giáp Tý 1444, quân Chiêm Thành kéo ra cướp thành châu Hóa, Lê Khôi được triều đình phái thống suất quân ở trấn Nghệ An đi tăng viện cho đạo quân của Tư đồ Lê Thận và Đô đốc Nguyễn Xí đánh đuổi quân xâm lược. Trận này quân Đại Việt thắng lớn, bờ cõi được bảo toàn. Ghi nhận công lao của Đốc trấn Lê Khôi, Vua Lê Nhân Tông đã tiến phong ông làm Nhập nội tham dự triều chính. Tuy nhiên, tình hình ở vùng biên thùy phía Nam lúc bấy giờ vẫn chưa thật ổn định do quân Chiêm Thành vẫn tiếp tục xâm phạm bờ cõi nên Lê Khôi không nỡ rời bỏ vùng đất, nơi mà người dân từng gửi gắm niềm tin và dành cho ông sự ngưỡng mộ, yêu quý. Chính vì vậy, ông đề nghị triều đình cho lưu lại trấn Nghệ An và được chấp thuận.
Chiếm trọn lòng tin của vua Lê, mùa xuân Bính Dần 1446, Lê Khôi tiếp tục được cử đem quân bản bộ phối hợp với các tướng: Lê Thụ, Trịnh Khả, Lê Khắc Phục tiến đánh quân phương Nam. Lần này, ông chỉ huy binh sĩ “tả xung hữu đột” phá tan đồn lũy của quân Chiêm Thành ở vùng biên ải, rồi truy đuổi vào tận sào huyệt của chúng. Sử cũ chép rằng, nghe tiếng tướng quân Lê Khôi đã lâu, khi thấy quân Đại Việt tiến vào, tướng nước Chiêm Thành liền gọi sang hỏi: Có phải ông Tư mã đấy chăng? Lê Khôi liền bỏ mũ trụ ra để quân Chiêm Thành nhìn rõ mặt. Thấy thế, quan quân Chiêm Thành liền xuống ngựa sụp lạy, bủn rủn chân tay, buông kiếm. Ông cùng quân sĩ tiến tới đâu, quân Chiêm Thành tan vỡ tới đấy. Sau khi tiến đánh vào thành Đồ Bàn, bắt được Chúa Chiêm Thành là Bí Cai, ông rửa giáp cho thu quân về.
Con đường công danh của tướng quân Lê Khôi đang rộng mở, vận nước Đại Việt đang cần những con người như thế thì chẳng may trên đường thu quân về Bắc, Lê Khôi lâm cơn bạo bệnh rồi mất ở vùng núi Long Ngâm thuộc Thạch Hà, Hà Tĩnh ngày nay. Nhận được hung tin, nhà vua vô cùng thương xót, cho bãi triều 3 ngày đêm liền và sai quan hữu ty thay mặt triều đình vào thăm điếu; đồng thời truy phong Lê Khôi là Nhập nội đô đốc, tên thụy là Trung Hiền. Sau đó, ông còn được truy tặng Nhập nội kiểm hiệu Tư không, Bình chương sự, đổi tên thụy là Vũ Mục công.
Thương tiếc một vị quan thanh liêm, gần dân, một vị tướng tài ba, nhân dân châu Hoan đã lập miếu thờ Lê Khôi ngay tại nơi ông trút hơi thở cuối cùng. Ghi nhớ công lao của Lê Khôi, đến đời Quang Thuận (trị vì từ năm 1460 đến 1497), Vua Lê Thánh Tông truy tặng ông tước Chiêu Trưng vương; đồng thời sai Nguyễn Như Đổ soạn bài văn khắc vào bia đá dựng ở ngôi miếu thờ ông. Nay trên tấm văn bia trong ngôi đền thờ Nhập nội đô đốc Lê Khôi ở cửa biển Thạch Hà có đoạn: “Công lao còn ghi ở xã tắc, oai thế từng vang ở nước ngoài, ân tín cố kết ở nhân tâm...”.